| Tez Künye | Durumu | ||
| Coleoptera-specific (CRY3Aa) delta-endotoxin biosynthesis by a local isolate of Bt subsp. Tenebrionis, gene cloning and characterization / Bt subsp. Tenebrionis`in yerel bir izolatında kınkanatlılara karşı aktif (CRY3Aa) delta-endotoksin biyosentezi, gen klonlanması ve karakterizasyonu Yazar:ASLIHAN KURT Danışman: PROF.DR. GÜLAY ÖZCENGİZ ; Y.DOÇ.DR. MELEK ÖZKAN Yer Bilgisi: Orta Doğu Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı Konu:Biyoloji = Biology Dizin: | Onaylandı Yüksek Lisans İngilizce 2005 143 s. | ||
| oz 5JSUBSP. TENEBRIONIS ‘ İN YEREL BİR İZOLATINDA KINKANATLILARA KARŞI AKTİF (CRY3Aa) DELTA-ENDOTOKSİN BİYOSENTEZİ, GEN KLONLANMASI VE KARAKTERİZASYONU Kurt, Aslıhan Yüksek Lisans, Biyoloji Bölümü Tez Yöneticisi: Prof. Dr. Gülay Özcengiz Ortak Tez Yöneticisi: Y. Doç. Dr. Melek Özkan Ocak 2005, 126 sayfa Cry3Aa Kınkanatlılar takımından böcek larvalarına karsı öldürücü etkiye sahip 73 kDa’lık bir protoksindir. Proteazlar tarafından daha kararlı bir form olan 65 kDa’lık ö-endotoksine dönüştürülür. Bu çalışmanın ilk bölümü, Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis ‘in (Btt) yerli bir izolatı tarafından Kırıkanatlılara özgü 8-endotoksin biyosentezinin ve bunun organizmanın üremesi ve sporulasyonu ile olan ilişkisinin belirlenmesini içermiştir. Karşılaştırılan dört farklı besiyeri içinden (HCT, GYS, DSM ve C2) DSM besiyerinin diğer besiyerlerine kıyasla toksin üretimini daha iyi desteklediği, bu besiyerinde üretilen hücrelerde toksin üretiminin 72. ve 120. saatlerde en yüksek olduğu görülmüştür. viToksin üretiminin artırılmasına yönelik çalışmalarda farklı karbon ve nitrojen kaynaklarının, inorganik fosfatın ve diğer minerallerin etkileri test edilmiştir. 5 g.L _1 ile 10 g.L”1 aralığında artan glukoz ve sükroz konsantrasyonları muhtemelen sporlanmayı baskılamak suretiyle toksin veriminin düşmesine neden olmuşlardır. İnorganik fosfatm toksin biyosentezi üzerinde en dikkat çekici etkiye sahip olduğu bulunmuştur. 200 mM’lık inorganik fosfat konsantrasyonun toksin üretimini 5 misli artırdığı görülmüştür. DSM’nin “Nutrient broth” içeriğinin organik ve inorganik azot kaynaklarının farklı kombinasyonlarıyla özellikle amonyum sülfat ve Kasamino asitler ile değiştirilmesi Cry3Aa sentezini inhibe etmiştir. MnCİ2, FeS04 ve MgSCVın kontrol besiyerinde kullanılan konsantrasyonlarının (sırasıyla 10″5-10″7 M, 10″6 M ve 5.1 0″4 M) denenen diğer konsantrasyonlara kıyasla daha yüksek toksin üretimini sağladığı bulunmuştur. FeSCVın konsantrasyonunun düşürülmesi ya da besiyerine hiç ilave edilmemesi Cry3 Aa biyosentezinde düşüşe neden olmuştur. Yerli izolatın toksin üretim kapasitesi, Kınkanatlılar takımına mensup böceklere karşı aktif toksin üreten 30 farklı Bt susunun toksin üretim kapasiteleri ile kıyaslanmıştır. Karşılaştırılan suşların çoğu, yerli izolata çok benzer protein profilleri vermiştir. Çalışmanın son aşamasında, Btt izolatına ait cry3Aa geni PCR ile amplifiye edilmiş ve bir E. colil Bacillus vektörü olan pNW33N vektörüne klonlanmıştır. Rekombinant plazmid E. colVde çoğaltılmış ve cry3Aa geninin nükleotid dizisi analiz edilmiştir. Buna göre elde edilen amino asit dizilimi c/y3Aa’nın bugüne dek bilinen 10 farklı kuaterner sınıfını temsil eden GenBank’da mevcut dizileri ile karşılaştırılmıştır. Yerli izolatm ürettiği Cry3Aa proteinin bu proteinlere 97.4 %- 99.2 % oranında özdeş olduğu bulunmuştur. Bu sonuca göre gen, cry3Aa geninin 11. kuaterner sınıfını temsil edecektir. cry3Aa genini içeren rekombinant plazmid daha sonra Bs 168’i transforme etmekte kullanılmış ve ara konakçı olan bu organizmada genin orijinal üreticiye göre düşük seviyede ifade edildiği görülmüştür. Anahtar kelimeler: Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis; Cry3 Aa 8-endotoksin biyosentezi; regülasyon; cryi Aa geni, gen klonlanması. vii | |||
| ABSTRACT COLEOPTERA-SPECIFIC (CRY3Aa) DELTA-ENDOTOXIN BIOSYNTHESIS BY A LOCAL ISOLATE OF tfrSUBSP. TENEBRIONIS, GENE CLONING AND CHARACTERIZATION Kurt, Aslihan M. Sc, Department of Biology Supervisor: Prof. Dr. Gülay Özcengiz Co-Supervisor: Assist. Prof. Dr. Melek Özkan January 2005, 126 pages Cry3Aa is a 73 kDa protoxin toxic to insect larvae of Coleoptera order. It is processed to form a stable 65 kDa 8-endotoxin by endogenous proteases. The first part of this study involved the determination of the patterns of biosynthesis of Coleoptera-specific 8-endotoxin by a local isolate of Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis (Bit) in relation to its growth and sporulation. Among four different media compared (DSM, GYS, HCT and C2) Cry3Aa production was the highest in DSM, especially at 72nd h and 120th h of incubation. IVFor improvement of Cry3 Aa production, the effects of different carbon and nitrogen sources, inorganic phosphate and other mineral elements were tested. Increasing concentrations (5-10 g.L”1) of glucose or sucrose decreased the toxin yield probably by suppressing sporulation. Inorganic phosphate was found to have the most striking effect on toxin biosynthesis. 200 mM inorganic phosphate concentration resulted in 5 fold increase in Cry3 Aa yield. Cry3Aa production was greatly reduced when various combinations of organic and inorganic nitrogen sources, especially ammonium sulphate and Casamino acids were replaced with Nutrient broth in DSM. The highest Cry3Aa production was obtained in the media containing 10″ -10″ M MnCk, 10″ M FeSC>4 and 5.10″4 M MgS04, corresponding to their original concentrations in DSM. Decrease of iron concentration or its omission from the medium decreased the toxin yield. Toxin production capacity of our local isolate was compared with those of 30 different anti-Coleopteran Bt strains. Most of the strains producing this protein gave general protein banding patterns quite similar to that of our local isolate. Lastly, the cry3 Aa gene of the Btt local isolate was PCR-amplified and cloned into the E. colil Bacillus shuttle vector pNW33N. The recombinant plasmid was amplified in E. coli and the sequence of the cry3Aa was determined. Amino acid sequence deduced was found to be 97.4 %-99.2 % identical to the cry3Aa sequences (GenBank) of 10 different quaternary ranks. In this respect, the gene has to represent the 1 1th quaternary rank of the cryfi Aa ones. The recombinant plasmid carrying cry3Aa gene was next used to transform Bs 168 as an intermediate host and low level of expression was seen. Keywords: Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis; Cry3Aa 8-endotoxin biosynthesis; regulation; cryfh Aa gene, gene cloning. | |||